High Throughput Screening (HTS) dalam Pengembangan Obat

Dalam pembahasan sebelumnya di proses penemuan dan pengembangan obat, metode High-Throughput Screening (HTS) sempat disinggung sebagai teknik yang digunakan untuk menyeleksi ribuan lead compound sehingga ditemukan kandidat senyawa untuk dioptimasi. Kali ini akan dibahas secara rinci seputar HTS dan pengaplikasiannya berdasarkan pengalaman pribadi mengikuti proyek penelitian drug discovery and development.

Apa itu High-Throughput Screening?

High-throughput screening (HTS) merupakan metode yang digunakan untuk menyeleksi (screening) ribuan senyawa secara bersamaan dengan menggunakan perangkat yang terdiri atas mesin berbasis robot (otomatisasi), detektor yang sangat sensitif, dan perangkat lunak. Metode ini sudah digunakan sejak tahun 1990an ketika 96-well plate mulai diperkenalkan dalam pengujian biologi.

Tujuan penggunaan HTS

Tujuan penggunaan HTS adalah mempercepat proses pengembangan obat dengan cara melakukan screening senyawa dalam jumlah besar yang bisa mencapai ribuan senyawa dalam waktu singkat sehingga mengurangi biaya yang dibutuhkan untuk pengembangan obat.

Jumlah senyawa yang bisa diuji HTS

HTS bisa digunakan untuk menskrining seratus hingga 10.000 senyawa per hari. Bahkan, HTS tipe Ultra High-throughput Screening bisa digunakan untuk menguji 100.000 senyawa per harinya.

Jenis plate yang dibutuhkan untuk menjalankan HTS

Source plate
- Microtiter plate tempat menyimpan senyawa dengan konsentrasi tertentu yang dapat dideteksi robot untuk mentransfer senyawa dalam konsentrasi yang ingin diuji.
- Jenis plate yang digunakan adalah polypropylene microtiter well-plates
Destination plate
- Microtiter plate untuk kultur sel dan plate tujuan transfer senyawa (treatment sel)

Seperti yang disebutkan sebelumnya bahwa HTS menggunakan sistem robot (otomatisasi), maka semua plate yang digunakan harus ditempel barcode yang kelak akan dibaca oleh robot sehingga mampu mendeteksi dan membedakan plate mana yang berperan sebagai source atau sebagai destination. Barcode ditempelkan di sisi kanan plate.

Tahap kerja HTS

Identifikasi target
- Pertama-tama, peneliti menentukan senyawa uji yang berpotensi memiliki reaksi biokimia dengan target, contohnya apakah senyawa tersebut mengikat proten target, memicu reaksi enzimatik, atau aktivitas signaling pathways lainnya (misal: senyawa yang baru ditemukan atau obat yang berpotensi untuk dikombinasikan)
Preparasi dan manajemen senyawa
- Senyawa yang diujikan harus disimpan di dalam well-plate dengan konsentrasi yang dapat dideteksi oleh robot sehingga dapat ditransfer secara akurat ke destination plate
Skrining library HTS

Contoh aplikasi HTS dalam pengembangan obat

Disclaimer: dikarenakan alasan confidential, maka beberapa bagian dari pengalaman pribadi berikut telah dimodifikasi tanpa mengurangi ilmu dan wawasan terkait prinsip, cara, dan langkah kerja HTS.

Salah satu contoh penggunaan metode HTS dalam penemuan dan pengembangan obat adalah menyeleksi (skrining) sejumlah kandidat senyawa yang baru ditemukan oleh perusahaan drug discovery dan obat yang sedang dalam uji klinik ATAU telah dikomersilkan untuk kombinasi pengobatan kanker.

Pada ilustrasi berikut, kasusnya adalah senyawa baru Z ingin diuji efektivitasnya ketika dikombinasikan dengan 21 obat dalam uji klinik.

Pertama-tama, peneliti harus mengidentifikasi:

Sel kultur yang akan digunakan sebagai subjek uji
Daftar kandidat senyawa yang baru ditemukan dan akan diuji
Daftar obat dalam uji klinik ATAU yang telah dikomersilkan
Rentang konsentrasi senyawa yang akan diketahui dari pengujian IC50 yang telah dilakukan sebelumnya (Ps: metode HTS juga dapat digunakan untuk memperoleh IC50)

Cell seeding

Setelah 384-well plate telah dikondisikan untuk penanaman sel, selanjutnya dilakukan cell seeding menggunakan Biomek 4000 seperti ilustrasi berikut:

Jangan lupa tempelkan barcode destination plate agar robot dapat mendeteksi plate mana yang digunakan dalam eksperimen.

Dokumen yang harus disiapkan untuk “dibaca” oleh robot

Layout source plate

Setelah sel dikultur selama 24 jam, sel di-treatment dengan senyawa uji. Sebelumnya, persiapkan senyawa di source plate dengan layout sebagai berikut:

Sejumlah well dialokasikan untuk DMSO sebagai pelarut senyawa uji. Pastikan konsentrasi senyawa uji tidak terlalu kecil atau tidak terlalu besar untuk disa ditransfer oleh robot sehingga tercapai konsentrasi uji *treatment* senyawa yang diinginkan saat ditransfer ke *plate*. Robot akan secara otomatis mengatur seberapa banyak DMSO dan senyawa yang dibutuhkan untuk mencapai konsentrasi uji.

Ingat, tempelkan barcode source plate di sisi kanan plate sebagai identitas plate!

Layout senyawa uji di destination plate

Selanjutnya, buat layout senyawa uji untuk di-treatment ke kultur sel. Berikut adalah contoh layout 3×3, yaitu senyawa baru dan obat dalam uji klinik ATAU obat komersil yang juga diuji dalam masing-masing tiga konsentrasi yang berbeda.

Conc 1 merupakan konsentrasi uji terendah dan conc 3 sebagai konsentrasi uji tertinggi. Subs 1 merupakan senyawa A yang dikombinasikan dengan 21 obat lain (digunakan pada semua kombinasi). Baris B dan O dari kolom 2 hingga 23 dan F2, J2, dan N2 digunakan sebagai kontrol.

Skema itu tidak diinput ke komputer untuk dibaca robot, tetapi hanya untuk membantu kita membuat picklist.

Picklist

Apa itu picklist? Picklist adalah tabel yang berisi daftar senyawa uji, konsentrasi uji, dan lokasi well. Dokumen inilah yang akan dibaca oleh robot dan menjadi pedoman dalam mentransfer senyawa uji ke destination plate yang berisi kultur sel. Contohnya sebagai berikut:

INGAT! Pastikan nama senyawa yang di-input di source plate sama persis, tidak boleh lebih atau kurang satu huruf atau satu tanda baca pun karena mesin tidak akan membaca serta dianggap eror sehingga robot tidak akan menjalankan perintah.

Treatment senyawa uji ke kultur sel menggunakan robot

Selanjutnya, semua dokumen yang telah disiapkan di upload ke aplikasi di komputer dengan cara kerja sebagai berikut:

Pertama, source plate ditempatkan di rak cell culture plates terlebih dahulu yang selanjutnya akan diambil oleh robot dan masuk ke Echo. Unggah layout source plate dan picklist ke aplikasi di komputer. Kemudian, jalankan perintah yang dikenal dengan “survey”, yaitu robot akan memeriksa dan memastikan senyawa di source plate memenuhi kriteria konsentrasi yang bisa di-pick dan volume senyawa di-plate tidak terlalu sedikit dan tidak terlalu banyak (rentang volume: 15 µl-45 µl tiap well). Notes: jangan lupa source plate disentrifugasi terlebih dahulu untuk memastikan tidak ada tetesan senyawa yang menempel di dinding well yang berakibat eror dalam pembacaan volume.
Tahap selanjutnya adalah bridging, yaitu mempersiapkan robot untuk mengkoneksikan layout senyawa uji di source plate dengan destination plate agar dapat ditransfer secara akurat sesuai dengan konsentrasi uji yang diinginkan.
Pada proses transfer, masing-masing source plate dan destination plate ditempatkan di lokasi sesuai dengan yang telah diatur di komputer sehingga robot akan secara otomatis mengambil masing-masing plate. Di proses inilah barcode turut berperan penting agar robot dapat membedakan mana yang source plate dan destination plate! Jangan lupa destination plate yang berisi kultur sel disentrifugasi terlebih dahulu untuk memastikan semua cairan dalam well sinking ke dasar plate. Kenapa harus sinking ke dasar plate? Karena pada proses transfer di mesin bernama Echo, senyawa akan ditransfer dari source plate ke destination plate dengan posisi saling berhadapan, di mana source plate menghadap ke atas dan destination plate dalam posisi terbalik menghadap source plate. Lho memangnya media da selnya gak tumpah? NGGAK! Lol. Ingat! 384-well plate memiliki ukuran well yang sangat kecil sehingga dapat menahan media dan sel yang ada di dalamnya dengan baik. Selain itu, proses sentrifugasi juga menghilangkan kemungkinan adanya gelembung di media sel sehingga mengurangi keakuratan robot dalam membaca volume media yang terdapat di dalam well. Akibatnya? Mesin akan membaca proses sebagai eror ATAU jumlah senyawa yang ditransfer tidak akurat dan mengurangi akurasi dan presisi konsentrasi senyawa uji.

Semua proses transfer akan secara otomatis dilakukan oleh robot. Untuk satu 384-well plate dengan 21 senyawa uji, rata-rata waktu yang dbutuhkan oleh robot untuk mentransfer senyawa dari source plate ke destination plate maksimal 5 menit saja.

Setelah proses transfer, destination plate yang berisi kultur sel yang telah ditreatment dengan senyawa uji akan disimpan di dalam inkubator. Sedangkan, source plate disimpan di tabung nitrogen dan bisa digunakan kembali untuk pengujian berikutnya. Ingat! jumlah volume yang diambil untuk pengujian tadi hanya sedikit. Selama masih ada well kosong untuk menambah senyawa atau konsentrasi uji baru, maka source plate bisa digunakan kembali ASALKAN senyawa belum rusak.

Uji viabilitas sel

Setelah sel terpapar senyawa selama 72 jam, viabilitas sel diuji dengan FMCA. FMCA ini merupaka pengujian yang juga menggunakan automatic workstation. Bagaimana cara kerjanya? Nantikan di posting-an selanjutnya ya.

Bekerja di lab dengan robot tentu mengurangi tenaga dan uang yang harus dikeluarkan (walaupun investasi di awal untuk membeli mesinnya sangat mahal!). Namun, sebenarnya tidak segampang itu karena salah sedikit saja seperti ketidaktelitian dalam menginput nama senyawa, ketidaksengajaan mengetik tanda titik atau koma di dalam dokumen, spasi atau kekurangan volume senyawa 0,001 µl membuat robot tidak mau menjalankan perintah. Atau bahkan sering terjadi di mana robot tidak mau membaca dokumen yang diunggah lalu ketika iseng-iseng memindahkan semua isi dokumen ke file baru, robotnya langsung mau menjalankan perintah. It is annoying because we are basically doing nothing, we just make a new file with the same content.

Overall, high-throughput screening is an inevitable technology that we should use as part of drug discovery and development!